La pasada semana, Doña Sara Pérez Ferre presentó su trabajo final de grado (TFG) titulado: Análisis y determinación de metabolitos de
interés biotecnológico en el medio marino. Incidencias en el medio ambiente, realizado bajo la tutorización de los Doctores Miguel Ängel Suárez de Tangil Navarro y Argimiro Rivero Rosales. Este trabajo corresponde al Grado en Ingeniería Química de la Escuela de Ingenierías Industriales y Civiles de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria.
A continuación se presenta el resumen de dicho trabajo.
Resumen:
El objetivo del presente Trabajo de Fin de Grado
(TFG) se centra en el desarrollo de un método analítico que nos permita
cuantificar aminoácidos en el medio marino, dado su interés medioambiental, por
facilitar la incorporación de hierro en el metabolismo de los microorganismos
marinos, y su interés industrial, por sus múltiples aplicaciones
biotecnológicas.
Los aminoácidos son moléculas orgánicas constituidas
por un grupo amino, un grupo carboxilo y una cadena lateral específica para
cada aminoácido; que constituyen la unidad básica estructural de las proteínas,
además de cumplir con otras funciones metabólicas en las microalgas. Los aminoácidos
están presentes en el orden de microgramos por litro en el medio marino
formando parte de la materia orgánica disuelta, dado que son excretados por los
organismos marinos como ligandos.
El hierro (Fe) es un elemento traza esencial por su
papel en la fotosíntesis y por ser un factor limitante en la producción
primaria en el medio marino. Está presente en su forma reducida Fe(II), la
especie principalmente asimilable por el fitoplancton, y en su forma oxidada Fe(III),
la más estable termodinámicamente.
Las microalgas son un grupo diverso de
microorganismos unicelulares compuestos principalmente por proteínas y capaces
de sintetizar todos los aminoácidos, al contrario que los animales, que deben
incorporar algunos a través de su dieta. Esto convierte a las algas en un
atractivo para la industria alimenticia dada su alta calidad nutricional,
debida a su perfil de aminoácidos.
Los aminoácidos presentes en algas también
proporcionan suavidad, flexibilidad, elasticidad a la piel, e incluso
protección ante los rayos solares, siendo ingredientes codiciados en la
industria cosmética. Tienen importantes aplicaciones farmacéuticas al incluir
factores del crecimiento, hormonas e inmunomoduladores que son regeneradores,
antioxidantes y antiinflamatorios. Los aminoácidos activan el metabolismo de
las plantas acelerando su crecimiento, por lo que los biofertilizantes de
fitoplancton son ampliamente usados. Y, además, su capacidad complejante de
iones metálicos puede ser utilizada en la eliminación de metales pesados, como
el cobre, presentes en aguas contaminadas, mediante la biorremediación con
algas.
Como se ha observado que las concentraciones de
aminoácidos en los océanos son muy bajas, se ha utilizado la técnica de
extracción en fase sólida para la concentración de la muestra y el aislamiento
de los analítos. Dado las propiedades anfóteras de los aminoácidos, para su
retención se ha utilizado un cartucho de intercambio catiónico SCX. El cartucho
ha sido acondicionado con diferentes disoluciones para optimizar su capacidad
adsorbente, consiguiéndose una recuperación de aminoácidos
del 70-85%, que podría optimizarse al eliminarse interferencias de la matriz de
la muestra como la salinidad del agua de mar.
Se ha usado el espectrofotómetro UV-visible para la
cuantificación de los aminoácidos, por lo que ha sido necesario la
derivatización de las muestras, puesto que los analítos no captan energía en el
espectro de luz visible. La derivatización es una reacción que proporciona al
aminoácido una característica fácilmente medible como la coloración o fluorescencia.
El reactivo utilizado para ello fue el fenilo de isotiocianato (PITC) que
reacciona con el grupo amina de los aminoácidos dando lugar a derivados
detectables en el rango UV-visible. El método fue optimizado de modo que se
elimina la necesidad de que la reacción se produzca bajo una atmósfera inerte,
y la salinidad del agua de mar no interfiere con el uso del PITC; simplificando
considerablemente el proceso de derivatización.
Para la cuantificación de los aminoácidos se
prepararon curvas de calibrado para cada uno de los aminoácidos analizados,
obteniéndose en todos los casos un coeficiente de correlación de la recta mayor
a 0,99. Demostrando así, que el método de derivatización es aplicable a los
diferentes aminoácidos, incluso los que poseen aminas secundarias, como la
prolina.
De este modo, se ha conseguido aplicar una
metodología eficiente, simple y específica para la cuantificación de
aminoácidos en el medio marino que sienta las bases para el desarrollo de un
proceso que permita además la identificación de los aminoácidos presentes en
muestras reales gracias a la aplicación de técnicas más sofisticadas que la
espectrofotometría, como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
En
resumen, la determinación de aminoácidos en agua de mar y cultivos de
microorganismos marinos es fundamental para el desarrollo de la química
orgánica marina. Este trabajo contribuirá a mejorar el conocimiento sobre la
cantidad y tipos de aminoácidos presentes en las diferentes regiones oceánicas,
y también a conocer qué grupos funcionales están presentes para realizar
estudios en laboratorio con cada uno de ellos y su impacto en la biogeoquímica
de metales trazas.
The objective of this
Bachelor’s Degree Final Project is focused on the development of an analytical
method to quantify amino acids in the marine milieu, considering its
environmental interest in promoting the incorporation of iron in the metabolism
of marine microorganisms, and its industrial interest for its wide variety of
biotechnological applications.
Amino acids are
organic molecules constituted by an amino group, a carboxyl group and a
specific lateral chain for each amino acid; which constitute the basic
structural unit of proteins, besides carrying out other metabolic functions in
microalgae. They are present in the order of micrograms per litre in the marine
environment as part of dissolved organic matter, since they are excreted by
marine organism as ligands.
Iron (Fe) is an
essential trace element due to its role in photosynthesis and because it is a
limiting factor in primary production in the oceans. It is present in its
reduced form Fe (II), the species mainly assimilable by phytoplankton, and its
oxidized form Fe (III), the most thermodynamically stable.
Microalgae are a
diverse group of unicellular microorganisms composed mainly of proteins and
capable of synthesizing all amino acids, unlike animals, which must incorporate
some of them through their diet. This turns algae into an asset for the food
industry due to their high nutritional quality and their amino acid profile.
The amino acids
present in algae also provide softness, flexibility, elasticity to the skin,
and even act as sunscreens, being valuable ingredients in the cosmetic
industry. They have important pharmaceutical applications as they include
growth factors, hormones and immunomodulators that are regenerating,
antioxidant and anti-inflammatory. Amino acids activate the metabolism of
plants by accelerating their growth, so phytoplankton biofertilizers are widely
used. In addition, their complexing capacity of metallic ions can be used in
the elimination of heavy metals, such as copper, present in contaminated
waters, by bioremediation with algae.
As it has been
observed that the concentrations of amino acids in the oceans are very low, the
solid phase extraction technique has been used for the concentration of the
sample and the isolation of the analytes. Given the amphoteric properties of
amino acids, a SCX cation exchange cartridge has been used for their retention.
The cartridge has been conditioned with different solutions to optimize its
adsorbent capacity, achieving amino acid recovery of 70-85%, which could be
optimized by removing interferences from the sample matrix such as the salinity
of seawater.
The UV-visible
spectrophotometer has been used for the quantification of amino acids, so it
has been necessary to derivatize the samples, since the analytes do not absorb
energy in the visible light spectrum. Derivatization is a reaction that
provides the amino acid with an easily measurable characteristic such as
coloration or fluorescence. The derivatizing reagent used was isothiocyanate
phenyl (PITC) which reacts with the amine group of amino acids resulting in
detectable derivatives in the UV-visible range. The method was optimized in a
way that eliminates the need for the reaction to take place under an inert
atmosphere, and the salinity of seawater does not interfere with the use of
PITC; substantially simplifying the derivatization process.
For the
quantification of amino acids, calibration curves were represented for each of
the amino acids analysed, obtaining in every case a correlation coefficient
greater than 0.99. Demonstrating that the derivatization method is suitable to
the different amino acids, even those with secondary amines, such as proline.
In this manner, it
has been possible to apply an efficient, simple and specific method for the
quantification of amino acids in the marine environment, that sets the bases
for the development of a process that also allows the identification of amino
acids present in real samples, thanks to the application of more sophisticated
techniques than spectrophotometry, like high-performance liquid chromatography
(HPLC).
In summary, the
determination of amino acids in seawater and marine microorganisms cultures is
essential for the development of marine organic chemistry. This work will
contribute to improve the knowledge about the quantity and types of amino acids
present in the different oceanic regions, and also to know which functional
groups are present to carry out laboratory studies with each of them and their
impact on the biogeochemistry of trace metals.