sábado, julio 27, 2019

DEFENSA DE TFG: SARA PÉREZ FERRE

La pasada semana, Doña Sara Pérez Ferre presentó su trabajo final de grado (TFG) titulado: Análisis y determinación de metabolitos de interés biotecnológico en el medio marino. Incidencias en el medio ambiente, realizado bajo la tutorización de los Doctores Miguel Ängel Suárez de Tangil Navarro y Argimiro Rivero Rosales. Este trabajo corresponde al Grado en Ingeniería Química de la Escuela de Ingenierías Industriales y Civiles de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria.

A continuación se presenta el resumen de dicho trabajo.


Resumen:

El objetivo del presente Trabajo de Fin de Grado (TFG) se centra en el desarrollo de un método analítico que nos permita cuantificar aminoácidos en el medio marino, dado su interés medioambiental, por facilitar la incorporación de hierro en el metabolismo de los microorganismos marinos, y su interés industrial, por sus múltiples aplicaciones biotecnológicas.

Los aminoácidos son moléculas orgánicas constituidas por un grupo amino, un grupo carboxilo y una cadena lateral específica para cada aminoácido; que constituyen la unidad básica estructural de las proteínas, además de cumplir con otras funciones metabólicas en las microalgas. Los aminoácidos están presentes en el orden de microgramos por litro en el medio marino formando parte de la materia orgánica disuelta, dado que son excretados por los organismos marinos como ligandos.

El hierro (Fe) es un elemento traza esencial por su papel en la fotosíntesis y por ser un factor limitante en la producción primaria en el medio marino. Está presente en su forma reducida Fe(II), la especie principalmente asimilable por el fitoplancton, y en su forma oxidada Fe(III), la más estable termodinámicamente.

Las microalgas son un grupo diverso de microorganismos unicelulares compuestos principalmente por proteínas y capaces de sintetizar todos los aminoácidos, al contrario que los animales, que deben incorporar algunos a través de su dieta. Esto convierte a las algas en un atractivo para la industria alimenticia dada su alta calidad nutricional, debida a su perfil de aminoácidos.

Los aminoácidos presentes en algas también proporcionan suavidad, flexibilidad, elasticidad a la piel, e incluso protección ante los rayos solares, siendo ingredientes codiciados en la industria cosmética. Tienen importantes aplicaciones farmacéuticas al incluir factores del crecimiento, hormonas e inmunomoduladores que son regeneradores, antioxidantes y antiinflamatorios. Los aminoácidos activan el metabolismo de las plantas acelerando su crecimiento, por lo que los biofertilizantes de fitoplancton son ampliamente usados. Y, además, su capacidad complejante de iones metálicos puede ser utilizada en la eliminación de metales pesados, como el cobre, presentes en aguas contaminadas, mediante la biorremediación con algas.

Como se ha observado que las concentraciones de aminoácidos en los océanos son muy bajas, se ha utilizado la técnica de extracción en fase sólida para la concentración de la muestra y el aislamiento de los analítos. Dado las propiedades anfóteras de los aminoácidos, para su retención se ha utilizado un cartucho de intercambio catiónico SCX. El cartucho ha sido acondicionado con diferentes disoluciones para optimizar su capacidad adsorbente, consiguiéndose una recuperación de aminoácidos del 70-85%, que podría optimizarse al eliminarse interferencias de la matriz de la muestra como la salinidad del agua de mar.

Se ha usado el espectrofotómetro UV-visible para la cuantificación de los aminoácidos, por lo que ha sido necesario la derivatización de las muestras, puesto que los analítos no captan energía en el espectro de luz visible. La derivatización es una reacción que proporciona al aminoácido una característica fácilmente medible como la coloración o fluorescencia. El reactivo utilizado para ello fue el fenilo de isotiocianato (PITC) que reacciona con el grupo amina de los aminoácidos dando lugar a derivados detectables en el rango UV-visible. El método fue optimizado de modo que se elimina la necesidad de que la reacción se produzca bajo una atmósfera inerte, y la salinidad del agua de mar no interfiere con el uso del PITC; simplificando considerablemente el proceso de derivatización.

Para la cuantificación de los aminoácidos se prepararon curvas de calibrado para cada uno de los aminoácidos analizados, obteniéndose en todos los casos un coeficiente de correlación de la recta mayor a 0,99. Demostrando así, que el método de derivatización es aplicable a los diferentes aminoácidos, incluso los que poseen aminas secundarias, como la prolina.

De este modo, se ha conseguido aplicar una metodología eficiente, simple y específica para la cuantificación de aminoácidos en el medio marino que sienta las bases para el desarrollo de un proceso que permita además la identificación de los aminoácidos presentes en muestras reales gracias a la aplicación de técnicas más sofisticadas que la espectrofotometría, como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

En resumen, la determinación de aminoácidos en agua de mar y cultivos de microorganismos marinos es fundamental para el desarrollo de la química orgánica marina. Este trabajo contribuirá a mejorar el conocimiento sobre la cantidad y tipos de aminoácidos presentes en las diferentes regiones oceánicas, y también a conocer qué grupos funcionales están presentes para realizar estudios en laboratorio con cada uno de ellos y su impacto en la biogeoquímica de metales trazas.


Abstract:

The objective of this Bachelor’s Degree Final Project is focused on the development of an analytical method to quantify amino acids in the marine milieu, considering its environmental interest in promoting the incorporation of iron in the metabolism of marine microorganisms, and its industrial interest for its wide variety of biotechnological applications.

Amino acids are organic molecules constituted by an amino group, a carboxyl group and a specific lateral chain for each amino acid; which constitute the basic structural unit of proteins, besides carrying out other metabolic functions in microalgae. They are present in the order of micrograms per litre in the marine environment as part of dissolved organic matter, since they are excreted by marine organism as ligands.

Iron (Fe) is an essential trace element due to its role in photosynthesis and because it is a limiting factor in primary production in the oceans. It is present in its reduced form Fe (II), the species mainly assimilable by phytoplankton, and its oxidized form Fe (III), the most thermodynamically stable.

Microalgae are a diverse group of unicellular microorganisms composed mainly of proteins and capable of synthesizing all amino acids, unlike animals, which must incorporate some of them through their diet. This turns algae into an asset for the food industry due to their high nutritional quality and their amino acid profile.

The amino acids present in algae also provide softness, flexibility, elasticity to the skin, and even act as sunscreens, being valuable ingredients in the cosmetic industry. They have important pharmaceutical applications as they include growth factors, hormones and immunomodulators that are regenerating, antioxidant and anti-inflammatory. Amino acids activate the metabolism of plants by accelerating their growth, so phytoplankton biofertilizers are widely used. In addition, their complexing capacity of metallic ions can be used in the elimination of heavy metals, such as copper, present in contaminated waters, by bioremediation with algae.

As it has been observed that the concentrations of amino acids in the oceans are very low, the solid phase extraction technique has been used for the concentration of the sample and the isolation of the analytes. Given the amphoteric properties of amino acids, a SCX cation exchange cartridge has been used for their retention. The cartridge has been conditioned with different solutions to optimize its adsorbent capacity, achieving amino acid recovery of 70-85%, which could be optimized by removing interferences from the sample matrix such as the salinity of seawater.
The UV-visible spectrophotometer has been used for the quantification of amino acids, so it has been necessary to derivatize the samples, since the analytes do not absorb energy in the visible light spectrum. Derivatization is a reaction that provides the amino acid with an easily measurable characteristic such as coloration or fluorescence. The derivatizing reagent used was isothiocyanate phenyl (PITC) which reacts with the amine group of amino acids resulting in detectable derivatives in the UV-visible range. The method was optimized in a way that eliminates the need for the reaction to take place under an inert atmosphere, and the salinity of seawater does not interfere with the use of PITC; substantially simplifying the derivatization process.

For the quantification of amino acids, calibration curves were represented for each of the amino acids analysed, obtaining in every case a correlation coefficient greater than 0.99. Demonstrating that the derivatization method is suitable to the different amino acids, even those with secondary amines, such as proline.

In this manner, it has been possible to apply an efficient, simple and specific method for the quantification of amino acids in the marine environment, that sets the bases for the development of a process that also allows the identification of amino acids present in real samples, thanks to the application of more sophisticated techniques than spectrophotometry, like high-performance liquid chromatography (HPLC).

In summary, the determination of amino acids in seawater and marine microorganisms cultures is essential for the development of marine organic chemistry. This work will contribute to improve the knowledge about the quantity and types of amino acids present in the different oceanic regions, and also to know which functional groups are present to carry out laboratory studies with each of them and their impact on the biogeochemistry of trace metals.